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學術支持
MTT實驗前的注意事項
2021-8-22

實驗前應明確的問題

1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大,因此,在進行MTT實驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以培養終止致細胞過滿。這樣,才能MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。

2. 藥物濃度的設定。要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。

3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值,輸入excel表,后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什么時候變得平坦了(到了平臺期)那個時間點應該就是好的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制表現的明顯)。

4. 培養時間。200ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止,影響結果,我們是在48h換液的。

5. MTT實驗法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞數。做MTT實驗時,盡量無菌操作,因為細菌 也可以導致MTT比色OD值的升高。

6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。

7. 實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜 。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。

8. 避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加,會試驗敏感性。因此,一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。在呈色后,盡量吸凈培養孔內殘余培養液。




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